Laboratorio de Tejidos vegetales, Facultad de ciencias naturales físicas y exactas, Universidad de Santander - UDES.
By: Julie chacon Orozco
Vivana Dueñas Bohórquez
RESUMEN:
En este trabajo se ajustaron las concentraciones de hormonas para la estimulación de órgano génesis en callos friables, obtenidos a partir de parénquima de zanahoria. Fueron 14 tratamientos utilizados en los cuales se tomaron diferentes concentraciones de 2.4D Y BAP, dos de estos tratamientos no contenían hormonas.
Según los resultados obtenidos, se evidencio que el tratamiento que no contenía hormonas ni agua de coco fue más efectivo en la formación de plántulas, los demás tratamientos estimularon el crecimiento de callos friables.
Palabras claves: Organogénesis, callos friables, regeneradores de crecimiento, ANA y BAP.
INTRODUCCION
La totipotencialidad celular había sido anunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teoría de que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas.
Este autor, sin embargo, no pudo demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular porque los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento, aún desconocidos en ese entonces. Los avances en cultivo de tejidos fueron muy lentos en sus inicios.
En 1934, White pudo mantener en forma ilimitada el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices de tomate. Al mismo tiempo se identificó el ácido indolacético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido in Vitro de callos de zanahoria y tabaco.
La generación es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar.
De Klerk y colaboradores en 1997 denominaron a estas diferentes fases como fase de adquisición de la competencia, fase de inducción y fase de realización.
En la primera fase las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa entre el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado.
A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa sin la formación de callo.
De esta forma podemos definir morfogénesis como el conjunto de los fenómenos relativos a la diferenciación celular y el desarrollo de los tejidos y órganos de la planta, la Diferenciación comprende los cambios morfológicos y fisiológicos que conllevan a la especialización de las células y a la formación de los diferentes tejidos y órganos de la planta. En todas las plantas se presentan las células embrionarias diferenciadas y es a partir de ellas que ocurre la diferenciación de los tejidos permanentes primarios de la planta.
Los cuatro factores principales que condicionan la obtención y el crecimiento de nuevos órganos en condiciones in Vitro son:
• El genotipo
•Las condiciones químicas seleccionadas para realizar el cultivo
• Las condiciones físicas seleccionadas para realizar el cultivo
• El explante.
El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfogénicos desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in Vitro así como también para la proliferación de callo, o la diferenciación y crecimiento de nuevos órganos.
Por esta causa, no es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo debido
a que los medios de cultivo como las condiciones de cultivo seleccionados, deben ser
Específicos para cada situación en particular.
Un ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp y Meredith en diferentes Cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtención de embriones somáticos a partir de embriones zigóticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar Pinot Nor.
Existen varios compuestos químicos que influyen en los patrones morfogénicos in vitro dentro de los cuales podemos considerar:
La composición salina del medio de cultivo. La composición salina más empleada para inducir la formación de callo, la organogénesis directa o indirecta en la mayoría de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseñadas para inducir determinados patrones morfogénicos. Existe, además, una estrecha relación entre la composición hormonal del explante y la concentración de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo.
Reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfogénesis aun cuando la concentración salina no sea la adecuada. En condiciones óptimas de cultivo pueden incrementar significativamente la diferenciación de órganos. En muchas de las especies vegetales, para la inducción de embriones somáticos, es necesario el agregado de auxinas como ocurre en Tilia spp.; sin embargo, para otras, como es el caso del crotón (Codiaeum variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentración de reguladores del crecimiento empleados están estrechamente relacionados.
Agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio
de cultivo. Puede emplearse como semisólido o líquido. El agente gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído
de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotorasdel crecimiento.
Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadasen una solución de MS con el agregado de 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP, donde se observó una respuesta morfogénica diversa según el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de producción nacional, se observó una gran diferenciación de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la proliferación de callo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron los callos friables obtenidos a partir de parénquima de zanahoria, y se eliminaron por medio de cortes las partes de los callos que presentaban necrosis. Estos fueron llevados a nuevos medios que contenían 2.4 D a concentraciones entre 0.05 – 0.1 ppm con y sin agua de coco, además algunos contenían BAP en concentraciones de 0.1 a 0.5 ppm como se muestra en la tabla siguiente:
Tratamientos
Tratamiento 2.4 D mg/l BAP mg/l Agua Coco ml
El transplante de los callos a los nuevos medios, se realizo en la cámara de flujo laminar y los materiales utilizados eran totalmente estériles, esto con el fin de evitar contaminación que pueda afectar el proceso de órgano génesis.
Posteriormente se mantuvieron en incubación durante 4 semanas, en las cuales se realizaron seguimientos semanales a todos los tratamientos, para de esta forma verificar cual de las concentraciones era la adecuada para inducir morfogénesis en los callos (fig 1).
RESULTADOS
DISCUSIÒN
A partir de los datos obtenidos, se pudo comprobar que los medios que no contenían BAP estimularon eficazmente la organogénesis a partir de callos. Siendo más eficiente el tratamiento #1, en este medio se pudo evidenciar la formación de tallos y hojas en 6 de los 18 callos cultivados. En los tratamientos 2, 4, 5, 8 y 14 se observo morfogénesis en menor proporción y poco diferenciados. Los demás tratamientos estimularon la formación de callos friables, grandes de color verde claro predominante, aunque después de la tercera semana, se presento un aumento en la necrosis de los callos. En la cuarta semana los tratamientos 1 y 14 presentaron mayor necrosis en 11 de sus callos.
CONCLUSIÓN
Según los datos obtenidos en el laboratorio, después de realizar 14 tratamientos diferentes se pudo evidenciar, que el tratamiento numero uno, el cual no contenía agua de coco ni hormonas de crecimiento, estimulo satisfactoriamente organogénesis en callos. De acuerdo a esta experiencia podemos concluir que no es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo debido a que los medios de cultivo , las condiciones físicas y explantes utilizado para la formación del callo, son variables que afectan los resultados experimentales ,por tanto cada experiencia realizada es única y cada resultado refleja la capacidad de las células vegetales para adaptarse al medio al cual que es sometida y de acuerdo a las características de este medio generar callo, o producir la diferenciación y crecimiento de nuevos órganos.
La ocurrencia de necrosis a partir de la cuarta semana de cultivados los callos posiblemente se debe a que el medio ya no contenía los suficientes nutriente para el mantenimiento de los mismos.
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