Aislamiento de klebsiella pneumoniae

By: Julie G. Chacon Orozco
Kelly Laverde Rodriguez

Objetivos

* Estudiar las propiedades de un microorganismo dado y manejarlo en cultivo axenico.

* Determinar mediante diferentes pruebas y agares, las diferentes reacciones y mecanismos de vida que puede desarrollar dicho microorganismo.

* Aislar la muestra para obtener una sola célula libre de contaminantes u otros microorganismos, mediante diferentes repiques.

* Identificar por medio de pruebas bioquímicas ( api 20E ) el tipo de microorganismo.

Introduccion

Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes en un sustrato, forzándolos a crecer en medios de cultivos artificiales.

Formando asi un Cultivo puro, este es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha obtenido a partir de una sola célula. En un cultivo puro, no necesariamente todas las células que lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran mutaciones y se diferencien de las restantes.

Cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denomina cepas.

En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y luego su posterior identificación (familia, género, especie).

*Aislamiento de bacterias

el método utilizado en nuestro trabajo, para la obtención de cultivo puro, fue:

Siembra en estrías en placas de Petri.

Mediante un asa de punta previamente esterilizada en la llama de un mechero y enfriada en el agar, se deposita en un medio sólido, una pequeña cantidad de la muestra y se distribuye extendiéndola sobre ella. De este modo, las bacterias se van distribuyendo sobre la superficie del agar y separándose unas de otras. Los microorganismos se adhieren a la superficie del medio y se multiplican formando colonias. Cada una de estas colonias se ha originado a partir de la multiplicación de una sola célula. Al trasladar una de estas colonias aislada a una nueva placa (repique), se obtendrá un cultivo puro en el que todas las colonias presentarán las mismas características.

*IdentificacionMediante diferentes pruebas bioquimicas y agares determinados , obteniendo  K. pneumoniae de espuma biologica (foaming) en aguas contaminadas.

Sitios y fuentes
Zona de GI, flora normal
oropharynx, flora normal
zona respiratoria, flora normal
pulmones, patógeno
alcohólicos, patógeno
quemaduras, patógeno

Factores De diagnóstico
colonias rosadas en el agar de McConkey
Gas  en TSI 
crecimiento en medios selectivos (McConkey y  EMB)
sulfuro del hidrógeno
indol
lactose+
urease+ (débil)
ningún gas-TSI
no motile
encapsulado

Las bacterias del genero Klebsiella son distinguidos por la presencia de un polisacárido capsular, de el cual hay 77 tipos antigenos. Las colonias son grandes y altamente mucoide. Aunque los pneumoniae del klebsiella pueden causar una pulmonía severa, es lo más comúnmente posible la causa de las infecciones en hospital adquiridas de la zona urinaria o de las infecciones de la herida de la quemadura.

INDICACIONES DEL LABORATORIO:
Lisina +
Citrato +
Indol –
+/+ TSI (con el gas)
No motil
Ornitina -

Las bacterias coliformes al verse afectadas por la presencia de antibioticos o diferentes agentes quimicosdesarrollan formas filamentosas; Si la cantidad de filamentos es alta y el proceso de depuración es por fangos activados podemos encontarnos con dos tipos de problemas biológicos:

* Esponjamiento filamentoso o Bulking
Los filamentos interfieren en la compactación del flóculo en el decantador secundario. Este efecto causa grandes problemas de sedimentación en el sedimentador secundario.

* Espumamiento biológico o Foaming
Los microorganismos filamentosos producen una espesa espuma coloreada (en colores del blanco al marrón) y en muchos casos abundantes flotantes.

La frecuencia de aparición de estos dos problemas biológicos, juntos o por separado, en la depuracion de aguas residuales, de todo el mundo obliga a utilizar la observación microscópica como método de detección de estos microorganismos.

* La observación microscópica como método de identificación de filamentos

Mediante el empleo del microscopio óptico y una serie de técnicas de cultivo, medición y tinción podemos identificar los microorganismos filamentosos. Si aplicamos alguna rutina de recuento podemos además cuantificar su presencia y relacionarla con los efectos que producen en el tratamiento biológico.

Para poder identificar microorganismos filamentosos necesitamos de forma imprescindible un microscopio binocular equipado con contraste de fases y unos objetivos de, al menos, 10x y 100x oil. Gracias a esta modificación de la iluminación se ponen de manifiesto los detalles estructurales de las células bacterianas que contribuyen a la identificación.

Materiales

*Muestra de la espuma biológica
* Cajas de pretri con:
Agar nutritivo
Agar MacConkey
* Asas bacteriológicas:
Punta recta
Punta redonda
* mechero
* Pipetas estériles
*Agua destilada
*Aceite mineral
* Api 20E
* Palillos estériles
* Reactivos:
Oxidasa
TDA
VpA- VPB
James

Metodo

1.Toma de muestra
Espuma biológica (foaming)
quebrada que pasa por cenfer


2. Visualizacion del examen directo
El sistema de siembra en estrías en placas de Petri con medios sólidos es el procedimiento habitual para aislar bacterias en cultivos puros:

- Se extiende el inóculo sobre una pequeña zona de la placa de Petri.
- Se esteriliza el asa para trazar las estrías a partir del inóculo depositado. Se siembra por agotamiento para tratar de separar las colonias.


3. Repique de una colonia (cultivo axenico)

MCK- Colonia fermentadora

4. Descripción macroscópica:

tamaño: mediana
borde: ondulado
elevación: convexa
superficie: lisa
consistencia: mucoide
aspecto: mate y opaco
cromogenesis: morado-rojizo.

5. Visualizacion de la coloracion de gram (bacilos gram negativos)
Solución salina-extendido
violeta de genciana (colorante primario)
Lugol (mordiente)
alcohol acetona (decolorizador)
safranina (colorante de contraste)

6. Identificacion mediante pruebas bioquímicas

Api 20E



Conclusiones

*Se identificó por medio de determinadas pruebas bioquímicas se pude llegar a conocer un microorganismo.

* Trabajamos con las normas presentes para no contaminar el medio y obtener una excelente identificación del microorganismo

* Tuvimos en cuenta las diferentes normas de bioseguridad; Como mecanismo de protección, puesto que estabamos trabajando con un microorganismo patógeno, que afecta infecciosamente los pulmones.

* Las bacterias coliformes constituyen gran parte de la flora normal del intestino; Dentro de el estos microorganismos no provocan enfermedad, y pueden incluso contribuir al funcionamiento normal y a la nutrición.

* Los microorganismos filamentosos producen una espesa espuma coloreada (en colores del blanco al marrón)

* La espuma que se producen en el agua contaminada son causas por microorganismos coliformes, los cuales al reaccionar con diferentes antibióticos o productos químicos (condiciones desfavorables), desarrollan formas filamentosas largas, gracias a la rica presencia de cápsulas grandes de polisacaridos

* La K. pneumoniae en grandes cantidades en el agua, se agrupan en flóculos. Estos microorganismos son en su mayor parte bacterias heterótrofas que utilizan la contaminación orgánica para formar biomasa celular nueva y reproducirse.

* Las colonias de Klebsiella pneumoniae tienden a confluir (escurrirse) cuando la incubación se prolonga.

bibliografia
*www. medic_med_uth_tmc_edu-path-00001506.htm
* www. vitalsigns. com/
* www. Realce.com/fram/limpieza.html
* manual de microbiologia medica 4° edicion